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随着生物技术的创新发展，许多创新性的技术经过多年的积累和研究的深入，逐步取得重大突破，促进了创新型药物的产业化，推动生物医药行业从具有发展潜力的高技术产业逐步转变为蓬勃发展的高技术支柱产业。
2023 年，哪些生物医药技术在未来 1-3 年具备产业影响力、生物医药产业应用创新有哪些新趋势？
DeepTech 密切关注行业发展最新动向，通过文献统计、数据分析、专家访谈等手段，洞悉生物医药技术发展趋势，探寻具备技术颠覆性、具有产业化前景的先进生物医药技术，并客观真实地阐述其发展现状，展望 2023 年十大生物医药技术趋势。
扫码查看完整报告DeepTech 正式发布《2023 生物医药技术趋势展望》研究报告。十项生物医药技术展望，涵盖了生命科学和生物医药的底层技术 CRISPR-Cas 基因编辑技术、酶促 DNA 合成、药物递送系统，从基础研究进入临床阶段的异种器官移植、CAR-NK 细胞治疗、噬菌体疗法，实现赛道破冰的微生态疗法，以及实现产业化并将有更多创新突破的 mRNA 药物、抗体偶联药物、双特异性抗体。
2023 年，生物医药技术新趋势将重塑产业发展格局，它们可能会对未来生物医药产业的研究方向产生重大影响。未来，生物医药底层技术的革新将推动创新药物从基础研究走向临床试验，并最终实现产业化，推动创新药物研究和生物医药产业发展进入革命性变化的时代，最终为人类的生命健康保驾护航。
基础技术篇 —— 基础技术的突破不断引领生物医药创新前沿
基础技术的突破不断引领生物医药创新前沿。新型基础技术的出现和改进会引领相关领域爆炸式发展，加速临床应用和产业化进程，从而解决更多尚未满足的临床需求。
CRISPR-Cas 系统的发现引领了基因编辑领域突破性发展，技术改进将追求精准化、灵活化、迷你化，促进基因编辑疗法的临床应用。酶促 DNA 合成将引领新一轮的 DNA 合成技术革命，实现长片段 DNA 高效率、高精度、低成本合成，极大地拓展 DNA 的应用范围，推动合成生物学的巨大进步。
药物递送系统是创新药物研发不可避免的话题，新型药物递送系统在不断涌现，大幅缩短创新药物研发周期，撑起创新药物研发的半边天。
CRISPR-Cas 系统是继 ZFN、TALEN 之后的第三代基因编辑技术。它的出现推动了基因编辑技术的发展，已经成为当今世界应用最广泛的基因编辑技术，成为生命科学最主要的底层技术之一。
CRISPR-Cas 系统主要由 Cas9 蛋白和单链向导 RNA（sgRNA）所组成，其中 Cas9 蛋白起切割 DNA 双链的作用，sgRNA 起向导的作用。在 sgRNA 的向导下通过碱基互补配对原则，Cas9 蛋白可对不同的靶部位进行切割，实现 DNA 的双链断裂。
根据 CRISPR-Cas 作用模块的数量和种类，CRISPR-Cas 系统分为两大类。第一类 CRISPR-Cas 系统由多个 Cas 蛋白亚基组成的多蛋白效应复合物和 crRNA 组成，又可细分为 I 型、III 型和 IV 型；第二类 CRISPR-Cas 系统为单一蛋白效应器，又可细分为 II 型、V 型和 VI 型。目前，已经鉴定的 CRISPR-Cas 系统中，以第一类 CRISPR-Cas 系统为主，占比多达 90% 左右，广泛分布于细菌和古生菌中。由于第一类效应复合物由多蛋白组成，基因编辑过程复杂，实用性不佳。
而第二类 CRISPR-Cas 系统由 Cas 蛋白发挥 DNA 或 RNA 的切割功能，切割靶序列效率高，且单个蛋白易于改造，因而第二类 CRISPR-Cas 系统被最早开发并广泛应用于基因编辑中。其中，最常用的是 Cas9、Cas12a 和 Cas13a。
▲图丨 Cas9、Cas12 和 Cas13 基因编辑原理图（来源：Molecular Cell）Cas9 是最早被发现和表征的二类 II 型效应蛋白，是目前应用最为广泛的 Cas 蛋白之一。Cas9 是由 crRNA 和反式激活 crRNA（tracrRNA）引导的 DNA 核酸内切酶。CRISPR 序列转录为 pre-crRNA，随后加工为成熟的 crRNA，并与 tracrRNA、Cas9 蛋白形成核糖核蛋白复合体。
当 Cas9 蛋白识别富含鸟嘌呤 PAM 序列（如 NGG，其中 N 代表任意核苷酸），并且 crRNA 与靶 DNA 序列互补，那么 Cas9 会在 PAM 序列上游约 3-4 个核苷酸对双链 DNA 进行切割，引发 DNA 双链断裂，形成平末端。
Cas12a，最早称为 Cpf1，是二类 V 型效应蛋白，也是目前应用最为广泛的 Cas 蛋白之一。Cas12a 同时具有 DNA 和 RNA 内切酶活性，可以不依赖于 tracrRNA 而将 pre-crRNA 加工为成熟的 crRNA。Cas12a 识别富含胸腺嘧啶的 PAM 序列（如 TTN），并在 PAM 序列下游对双链 DNA 进行切割，形成粘性末端。
与 Cas9 和 Cas12a 不同，Cas13a 是靶向 RNA 的核酸酶，属于二类 VI 型效应蛋白。Cas13a 与 crRNA、底物结合形成三元复合体后，Cas13a 蛋白被激活，对底物单链靶 RNA 进行切割。
▲图丨常用 Cas 蛋白特征（来源：Molecular Cell，DeepTech 整理）Cas 蛋白的固有缺陷限制了 CRISPR-Cas 系统的应用。PAM 序列限制了靶目标的范围，如 Cas9 识别的 PAM 序列为 NGG，在人类基因组中平均每八个碱基才有可能出现一个 PAM 序列，严重制约了其对基因组大部分位点的编辑。脱靶效应也是 CRISPR-Cas 系统面临的一大问题，gRNA 同靶序列的结合可以允许多个碱基的错配，这导致了基因编辑过程中会发生不可预测的脱靶，这对于精准的基因编辑来说是一个不可忽视的问题。
另外，由于常用的 Cas9、Cas12a 和 Cas13a 大小接近 4kb, 而递送系统 AAV 病毒的包装上限约为 4.7kb，不利于 CRISPR-Cas 系统的递送。这些问题都极大地影响了基因编辑的精准性、可控性、灵活性和安全性，限制了 CRISPR-Cas 系统新功能和应用范围的拓展。因此，优化改造 Cas 蛋白、寻找更小的 Cas 蛋白、发掘更优的新型系统等成为近年来 CRISPR-Cas 系统研究的重点方向。
优化改造 Cas 蛋白，提高基因编辑的精准性和灵活性。脱靶效应和 PAM 的序列限制是影响 CRISPR-Cas 系统应用的核心问题，因此需要对 Cas 蛋白进行优化改造，从而提高靶向特异性，克服脱靶率问题，并突破 PAM 限制，扩展靶序列的识别范围。目前，已经有众多工作开展，构建了多个 Cas 蛋白突变体。例如，通过合理设计并定向进化开发高保真的 Cas9 变体，得到高保真蛋白 enAsCas12aHF1。新开发的两种 Cas9 变体 SpG 和 SpRY，不需要特定的 PAM 来结合和切割 DNA 序列。
▲图丨部分工程化改造的 Cas 蛋白变体（来源：Synthetic Biology Journal，DeepTech 整理）Cas 蛋白迷你化提高 CRISPR-Cas 系统的递送效率。新开发的小型 Cas 蛋白 Nsp2-SmuCas9 嵌合体，长度约为 1000 氨基酸，可识别 N4C PAM 序列，但其编辑活性仍有待提高。迷你蛋白 Cas14，又称为 Cas12f1，只有 400-500 个氨基酸。近年，基于该蛋白又开发了多款迷你蛋白，如 DpbCas12e（约 1000 氨基酸）、Cas12j（又称 CasΦ， 700 氨基酸）、Un1Cas12f1（537 氨基酸）、AsCas12f1（422 氨基酸）、SpaCas12f1 （497 氨基酸）和 CasMINI（源自 Un1Cas12f1，529 氨基酸）。不过这些蛋白还存在编辑活性低的问题，有待进一步改进。
我国辉大基因开发了 Cas13X.1（又称 Cas13e.1，775 氨基酸）和 Cas13Y（又称 Cas13f，790 氨基酸），并于 2022 年获得美国专利局授予专利，成为我国首个自主研发的、在美国获得专利授权的 CRISPR-Cas13 基因编辑工具，打破了欧美在基因编辑工具领域的专利垄断。
发掘新型 Cas 蛋白，扩大 CRISPR-Cas 系统的应用范围。Cas7-11 是通过大数据挖掘找到的一类独特的 III-E 型 CRISPR-Cas 系统，与传统的多组分效应蛋白复合物不同，该系统具有单一的效应蛋白 Cas7-11（由传统的 Cas11 和 Cas7 融合而成），具有 crRNA 加工和序列特异性 RNA 切割活性，为哺乳动物细胞提供了一种新的 RNA 敲除工具，其脱靶效应比当前的 RNA 敲除技术更低。
2023 年首个 CRISPR 基因编辑疗法有望获批上市。CRISPR-Cas 系统的广泛应用推动了相关生物医药技术的发展。美国 Vertex 制药公司和 CRISPR Therapeutics 公司目前正在开发基于 CRISPR-Cas9 系统的 exa-cel 疗法，使用 CRISPR-Cas9 技术编辑有缺陷的基因系统治疗 β- 地中海贫血和镰状细胞病这两种遗传性血液疾病。2022 年 9 月，基于良好的临床试验结果，Vertex 公司和 CRISPR Therapeutics 启动 exa-cel 疗法的上市申请，有望于 2023 年获批上市。
酶促 DNA 合成是指在不依赖于 DNA 模板的情况下，通过酶促反应实现 DNA 分子的从头合成。这个技术的核心便是实现酶促反应的末端脱氧核苷酸转移酶（terminal deoxynucleotidyl transferase，TdT）。
TdT 是一种不依赖于 DNA 模板的单链 DNA 合成酶，整个催化过程中不需要经过变性、复性和延伸反应，在恒温和金属离子辅助的条件下，催化脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP）聚合到寡核苷酸的 3' 末端，从而合成寡核糖核苷酸链。TdT 具有无模板依赖的快速聚合活性，能够实现长链 DNA 合成。另外，TdT 对底物的选择性较低，dNTP、核糖核苷三磷酸（rNTP）以及修饰的核苷三磷酸类似物均可以作为的 TdT 底物。
化学合成法在 DNA 合成长度、成本和环保等方面存有问题。目前，市面中最常用的 DNA 合成方法是固相亚磷酰胺三酯法。该化学合成法需要 4-5 个反应步骤，每个步骤可能会有错误，随着合成链的延长，合成的准确率会大幅下降，合成产物得率也明显下降。这导致化学合成法合成的 DNA 片段长度最多能达到 200-300nt。
若想得到更长的 DNA 片段，需要将短片段不断拼接组装，拼接组装过程大幅增加了长链 DNA 合成成本。另外，化学合成法需要大量使用有毒化学试剂，合成产生的废液、废气需要特殊处理。
酶促 DNA 合成技术推动 DNA 合成技术再次升级。酶促 DNA 合成技术只需要 2-3 个反应步骤，可以提高 DNA 合成的准确率，缩短 DNA 合成时间。酶的高特异性支持长片段 DNA 的合成，或能够合成长达 8000nt 的 DNA 序列，酶促合成技术有望将长片段 DNA 合成的成本降低 2-3 个数量级。
酶促 DNA 合成反应在温和条件和水相中进行，整个催化合成过程绿色环保，不产生危险废物废液。与化学合成法相比，酶促 DNA 合成技术在 DNA 合成长度、准确率、成本及环保等方面具有巨大的潜力，因而被认为将引领新一轮的 DNA 合成技术革命。
▲图丨 TdT 两步循环合成 DNA （来源：ACS Cataliysis）酶促 DNA 合成技术日趋成熟，极具商业化潜力。目前，市场上出现了一批以酶促 DNA 合成技术为核心的商业化公司，如 Molecular Assemblies、Nuclera、DNA script、Ansa Biotechnologies 等。Molecular Assemblies、Nuclera 和 DNA script 这 3 家公司均是以 TdT 酶为核心，通过修饰核苷酸分子制备带有可逆终止基团的核苷酸单体，该修饰的核苷酸单体使 TdT 酶每次只添加单个碱基，之后去除掉新添加碱基的可逆终止基团后开始下一个碱基的合成，进而实现 DNA 的合成。
其中，Molecular Assemblies 和 Nuclea 可逆终止基团选择的是 3’-O - 叠氮甲基，DNA script 选择的是 3’-O - 氨基。2022 年 4 月，DNA script 推出基于专有酶促 DNA 合成技术的 DNA 打印机 SYNTAX，并推出早期使用计划，允许客户率先使用 SYNTAX 平台。
Ansa Biotechnologies 公司开发了 dNTP-TdT 偶联体介导的可逆终止合成法。该方法将碱基偶联在 TdT 上，酶促合成过程中每添加一个 dNTP-TdT 后，由于 TdT 共价结合在合成 DNA 的 3’端，阻止了新碱基的继续添加，随后再通过偶联 TdT 的剪切、洗去、再添加实现碱基逐个添加到 DNA 的 3’端，从而合成 DNA。2022 年，该公司获得 6800 万美元融资，用于加速基于 dNTP-TdT 的酶促 DNA 合成技术的开发，构建高通量合成仪器。
中国团队实现酶促 DNA 合成的重大突破，提高 DNA 合成的效率和准确度。2022 年，中国科学院天津工业生物技术研究所江会锋团队通过生物信息学的技术筛选到高效催化活性的鸟类 TdT；通过理性设计和高通量筛选策略，对筛选到的鸟类 TdT 进行改造，重塑 ZaTdT 催化活性腔，获得新的 TdT 突变体，即 ZaTdT-R335L-K337G，该突变体的催化效率比哺乳动物 TdT 催化效率高 3 个数量级，大幅提升了对氧氨基修饰核苷酸（3'-ONH2-dNTPs）的特异性识别和催化合成能力。
利用 ZaTdT-R335L-K337G 可以通过两步循环步骤实现 DNA 的合成，平均准确率可以达到 98.7%，媲美商业化的 DNA 化学合成法。下一步该团队瞄准长片段 DNA 合成，通过优化合成系统，使得酶在每个催化合成步骤都保持高活性，合成 500-1000nt 长度甚至更长的 DNA 片段，并将准确率维持在 99.5%-99.8%，从而解决长片段 DNA 合成的难题。
酶促 DNA 合成技术仍处于起步阶段，但是新技术的出现给高效率、高精度、低成本合成长片段 DNA 带来了希望，将会对 DNA 合成技术变来一场技术革命，代表了 DNA 合成的新的发展方向。DNA 尤其是长片段 DNA 的生物合成如果能够实现，将极大地拓展 DNA 分子的应用范围，推动合成生物学的进步。
药物递送系统（Drug Delivery System,DDS）是将药物递送到药理作用靶点的系统，涵盖了药物制备、给药途径、位点靶向、代谢和毒理等方面的技术。在临床应用上，药物递送系统不仅发挥着将药物递送到靶点的作用，更重要的是还承担着药物靶向、药物控释、增强药物稳定性或促进药物吸收等多方面的作用，从而解决某些药物溶解度低、靶向效果弱、稳定性差等缺点，提高药物的治疗效果。
新型递送技术的突破和成熟推动了核酸药物的临床转化，撑起核酸药物研发的半边天。由于具有不稳定性、免疫原性、细胞摄取效率低、内吞体逃逸难等多方向的缺点，核酸药物从概念提出到基础研究再到有药物上市经历了较长的历程。对于核酸药物能够实现临床转化，递送系统发挥着至关重要的作用，只有通过递送才使得核酸形式的药物最终成药。目前，成熟的核酸药物递送系统有 GalNac（N - 乙酰半乳糖胺）偶联修饰、脂质纳米颗粒（lipid nanoparticle，LNP）和重组腺相关病毒（recombination adeno-associated virus, rAAV）载体。近些年来，外泌体作为一种新型的递送系统引起了研究人员的广泛关注。
GalNac 偶联修饰是当前最常用的小核酸药物递送系统，是核酸药物发展历程中的重大突破。GalNAc 能够与肝细胞表面的去唾液酸糖蛋白受体（ASGPR）特异性结合。之后，ASGPR 和网格蛋白介导的内吞作用可以将 GalNAc 转运至肝细胞内。GalNac 偶联修饰的小核酸药物提高了小核酸进入肝细胞的效率，解决了小核酸药物靶向性差、脱靶效应严重、稳定性差的缺点，提高了小核酸的临床效果。
但是，该递送系统也存在着一定的局限性，由于 ASGPR 在肝细胞表面特异性高表达，而在其他组织细胞中表达量极少，因而 GalNAc 偶联修饰的小核酸药物只能靶向肝细胞并在肝细胞内发挥作用，限制了小核酸药物在其他组织器官中发挥作用。全球已经批准上市 3 款 GalNac 偶联修饰 siRNA 药物，即 Givlaari、Leqvio 和 Oxlumo，均是由 Alnylam 公司研发，分别用于治疗急性肝卟啉症、高胆固醇血症和原发性高草酸尿症 1 型。
mRNA 新冠疫苗让 LNP 递送系统声名鹊起。LNP 是一种球状的包含脂质成分的实心纳米颗粒。LNP 包含有 4 类分子，分别是可电离的阳离子磷脂、中性辅助脂质、胆固醇和聚乙二醇修饰的磷脂。这 4 种成分按照一定的比例组装成 LNP，并在药物递送过程中发挥不同作用。可电离阳离子脂质是药物递送关键因素，在生理 pH 值下保持中性，降低药物的毒性和免疫原性；在低 pH 值下带正电，与带负电的 RNA 结合，并在被细胞内化后实现溶酶体逃逸。中性辅助脂质能够促进层状脂质结构的形成和稳定。胆固醇有较强的膜融合能力，能够促进 mRNA 的内化和进入胞质。聚乙二醇修饰的磷脂能够改善 LNP 的亲水性，防止 LNP 聚集，增加稳定性，并可以避免 LNP 被免疫系统清除。
新冠疫情促进了 mRNA 新冠疫苗的获批上市，BioNTech、Moderna 和 CureVac 三家公司的 mRNA 新冠疫苗均使用了 LNP 递送技术。在此之前，Alnylam 公司基于 LNP 递送系统研发的 siRNA 药物 onpattro 在美国获批上市，用于治疗肝脏甲状腺素转运蛋白（TTR）介导的淀粉样病变。该核酸药物是一款载有 siRNA 的 LNP，通过静脉输注将药物直接递送至肝脏，通过抑制 TTR 的合成来发挥治疗作用。
▲图丨 LNP 的结构示意图 （来源：molecules）rAAV 在基因药物递送上发挥重要作用。rAAV 是在非致病的野生型 AAV 基础上改造而成的基因载体。包裹基因表达系统的 rAAV 侵入靶细胞后，将包含有基因表达系统的遗传物质通过核孔复合体传递到细胞核内，最终在靶细胞中转录出相应的蛋白发挥治疗作用。rAAV 也可以往靶细胞中导入 shRNA 或者 CRISPR-Cas 基因编辑系统，从而实现基因沉默或基因编辑功能，达到基因治疗目的。
rAAV 具有安全性高、免疫原性低、种类多样等优势，且不同血清型的 rAAV 具有其独自的组织特异性，可以实现不同组织的基因药物递送。目前，全球共有 5 款 AAV 基因治疗药物获批上市（含退市的 Glybera）。2022 年，2 款新的 AAV 基因治疗药物在欧盟获批上市，极大地推进了 rAAV 作为递送系统在基因治疗领域的应用。
▲图丨已经获批上市的 AAV 基因治疗药物 （DeepTech 根据公开资料整理）外泌体有望成为新的核酸药物递送系统。外泌体是由细胞分泌的一种细胞外膜状脂质囊泡，大小在 40 -100nm，可以递送核酸、蛋白质、小分子等药物。作为天然内源性转运载体，外泌体具有多种先天优势，如细胞摄取效率高、不激活先天或后天免疫、可以通过血脑屏障传递到中枢神经系统等。正是具有这些先天优势，外泌体作为递送系统被研究用于治疗癌症、心血管疾病、帕金森症和阿尔茨海默病以及其他神经退行性疾病。
目前，外泌体代表公司 CODIAK 有 3 款基于工程化外泌体递送系统的创新药物进行 1 期临床。这 3 款药物利用工程化外泌体分别携带不同的药物（IL-12、STING 激动剂和靶向 STAT6 转录因子的反义寡核苷酸）靶向至相应的肿瘤组织，激活人体自身的免疫应答以杀伤相应的肿瘤细胞。Evox Therapeutics 公司开发了基于外泌体的核酸药物递送系统，递送 mRNA、siRNA、反义寡核苷酸以及 CRISPR 等，用于治疗罕见病和神经系统疾病。
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